一、服務(wù)簡(jiǎn)介
RT -PCR即逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶反應(yīng)。原理是：提取組織或細(xì)胞中的總RNA，以其中的mRNA作為模板，采用Oligo（dT）或隨機(jī)引物利用逆轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄成cDNA。再以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，而獲得目的基因或檢測(cè)基因表達(dá)。RT-PCR使RNA檢測(cè)的靈敏性提高了幾個(gè)數(shù)量級(jí)，使一些極為微量RNA樣品分析成為可能。該技術(shù)主要用于：分析基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物、獲取目的基因、合成cDNA探針、構(gòu)建RNA高效轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)。
逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng) (Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction，RT-PCR)的原理是：提取組織或細(xì)胞中的總RNA，以其中的mRNA作為模板，采用Oligo（dT）或隨機(jī)引物利用逆轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄成cDNA。再以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，而獲得目的基因或檢測(cè)基因表達(dá)。
二、技術(shù)流程
1、設(shè)計(jì)并合成Realtime PCR引物。
2、引物溶解后使用Promega的TaqDNA聚合酶進(jìn)行含SG（SYBR?； Green）的PCR反應(yīng)的優(yōu)化。
3、客戶(hù)樣品RNA抽提 。實(shí)驗(yàn)對(duì)象為組織樣品，取適量（50-100mg）新鮮組織樣品或正確保存的組織樣品加1ml的RNA抽提試劑Trizol（Invitrogen），勻漿后抽提RNA。 實(shí)驗(yàn)對(duì)象為細(xì)胞樣品，每份樣品取1×106～1×107細(xì)胞，PBS清洗細(xì)胞，去PBS加1mlRNA抽提試劑Trizol（Invitrogen），裂解后抽提RNA 。
4、RNA質(zhì)量檢測(cè)
a、紫外吸收測(cè)定法測(cè)定RNA在分光光度計(jì)260nm和280nm處的吸收值，以計(jì)算其濃度并評(píng)估RNA純度 。b、使用ambion公司的甲醛電泳試劑進(jìn)行變性瓊脂糖凝膠電泳，檢測(cè)RNA純度及完整性。
5.、使用逆轉(zhuǎn)錄酶（Promega）進(jìn)行反應(yīng)，將樣品RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。
6、制備標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)樣品： 進(jìn)行相對(duì)定量，需要先將樣品的目的基因以及管家基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，其產(chǎn)物進(jìn)行梯度稀釋用于做標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。
7、標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)樣品和待測(cè)樣品分別加入到含SG的RealTime PCR反應(yīng)液中，進(jìn)行 RealTime PCR擴(kuò)增和檢測(cè)。 8、檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)分析：以對(duì)待測(cè)樣品的目的基因進(jìn)行定量。相對(duì)定量實(shí)驗(yàn)需要進(jìn)一步用樣品的目的基因測(cè)得值除以管家基因測(cè)得值以校正誤差，所得結(jié)果代表某樣品的目的基因相對(duì)含量。
9、提供實(shí)驗(yàn)報(bào)告：包括詳細(xì)的實(shí)驗(yàn)方法及實(shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果的相關(guān)圖表
三、服務(wù)說(shuō)明
1、請(qǐng)您提供新鮮的且盡量多的材料，或直接提供純化好的總RNA或DNA（大于5ug/樣本）。如是如織：100－200mg
2、請(qǐng)通過(guò)EMAIL提供已知的全長(zhǎng)基因序列。Email:huameixinan@163.com
3、請(qǐng)?zhí)峁┰敿?xì)背景資料：DNA/RNA來(lái)源，豐度。
四、成果展示
五、詢(xún)價(jià)及訂購(gòu)
感謝您選擇我公司的RT-PCR檢測(cè)服務(wù)。如有相關(guān)問(wèn)題請(qǐng)聯(lián)系我們的工作人員。